Souverän durchs Praktikum: Macht Studierende der Biologie, Biochemie oder Biotechnologie fit für die ungewohnte Arbeitsumgebung eines wissenschaftlichen Labors
Fit fürs Labor: Molekularbiologie & Zellbiologie gibt Studierenden in den Biowissenschaften ein kompaktes Nachschlagewerk an die Hand, das alle wesentlichen molekularbiologischen und zellbiologischen Arbeitsmethoden erklärt. Von der Extraktion über die Aufreinigung zur Funktionsbestimmung von Nukleinsäuren und Proteinen, grundlegenden Zellkulturtechniken und immunchemischen Verfahren wird die Bandbreite biowissenschaftlicher Labortechniken abgedeckt. Zu einem erfolgreichen Laborversuch gehört auch die Vorbereitung des Versuchs und der dazu nötigen Materialien, die Dokumentation der gewonnenen Daten sowie deren Auswertung. Daher sind neben Schritt-für-Schritt-Erläuterungen zur Versuchsdurchführung zahlreiche Beispiel zur Analyse und Interpretation der aus dem Experiment gewonnenen Daten enthalten.
- Vom Ansetzen einer Stammlösung bis zur Durchführung eines biologischen Assays werden alle wichtigen Labortechniken erklärt
- Mehr als 40 Übungen und Beispielrechnungen sind enthalten, die die typischen Anforderungen und Aufgaben in einem Laborpraktikum abdecken
- Angereichert mit vielen hilfreichen Definitionen und kleinen Exkursen, die das Leben & Lernen leichter machen
Mit Fit fürs Labor: Molekularbiologie und Zellbiologie kann jede und jeder ein biowissenschaftliches Laborpraktikum meistern!
Cuprins
vorwort v
Glossar xv
Abkürzungen xxiii
1 Herstellung von Lösungen in der biowissenschaftlichen Forschung 1
1.1 Einführung 1
1.2 Konzentration 2
1.2.1 Molarität 2
1.3 Verwendung einer Waage zum Einwiegen von Reagenzien 3
1.3.1 Verwendung einer elektronischen Waage 3
1.3.2 Verwendung einer Präzisionswaage 5
1.3.3 Verwendung einer Analysenwaage 5
1.4 Praktische Überlegungen bei der Herstellung einer einmolaren Lösung (1, 0 M) 6
1.4.1 Herstellung von Lösungen mit einer Konzentration von weniger als 1, 0 M und einem Volumen von weniger als einem Liter 7
1.4.2 Herstellen von molaren Flüssigkeitslösungen 9
1.4.3 Herstellen von prozentualen Lösungen 11
1.4.3.1 Einwiegen in Volumen-Lösungen (w/v) 12
1.5 Verdünnungen und die Verwendung von Pipetten 12
1.5.1 Verwendung von zylindrischen Glas- oder Kunststoffpipetten mit Skala 14
1.5.2 Verwendung von Handmikropipetten 15
1.5.3 Verdünnung aus einer Stammlösung 17
1.6 Wasser, Säuren und Basen 18
1.6.1 Wasser als Lösungsmittel 19
1.6.2 Ionisierung von Wasser 20
1.6.3 Säuren und Basen 21
1.6.3.1 Starke und schwache Säuren 22
1.7 Puffer 22
1.7.1 Herstellung eines Puffers und Verwendung eines p H-Messgeräts 23
1.8 Gleichgewichts-/Dissoziationskonstante (K a) für eine Säure oder Base 25
1.8.1 Henderson-Hasselbalch-Gleichung 26
1.9 Zusammenfassung 27
1.9.1 Hinweise 27
2 Mikroskopie 29
2.1 Einführung 29
2.2 Mikroskope – Allgemeine Grundsätze 31
2.3 Prinzipien der Bilderzeugung 32
2.3.1 Maßeinheiten 32
2.4 Lichtmikroskopie 34
2.4.1 Hellfeldmikroskopie 34
2.4.1.1 Probenpräparation 35
2.4.1.2 Gram-Färbung für Bakterien 37
2.4.1.3 Hämatoxylin/Eosin-Färbung von Paraffin-Wachsschnitten 38
2.4.2 Phasenkontrastmikroskopie 39
2.4.3 Differentialinterferenzkontrast 39
2.4.4 Fluoreszenzmikroskopie 40
2.4.5 Verwendung eines Lichtmikroskops 43
2.4.5.1 Allgemeine Merkmale von Mikroskopen 43
2.4.5.2 Fokussieren einer Probe 44
2.4.6 Datenanalyse und -Präsentation 46
2.4.6.1 Zeichnen und Beschriften eines Mikroskopbilds 46
2.4.6.2 Größenmessungen mit einem Lichtmikroskop 47
2.4.6.3 Quantifizierung bestimmter Merkmale in mikroskopischen Proben 48
2.4.6.4 Anwendung der Mikroskopie bei der Zellzählung 49
2.5 Elektronenmikroskopie 51
2.6 Zusammenfassung 54
3 Spektralphotometrie 57
3.1 Einführung 57
3.2 Elektromagnetisches Spektrum 57
3.3 Absorption von Licht 60
3.3.1 Fluoreszenz 60
3.3.2 Lumineszenz 61
3.4 UV/VIS-Spektralphotometrie 62
3.5 Gesetzmäßigkeiten der Lichtabsorption 63
3.5.1 Lichtabschwächung (optische Dichte) 64
3.6 Lambert-Beersches Gesetz 64
3.6.1 Beschränkungen des Lambert-Beerschen Gesetzes 66
3.7 Spektralphotometer 67
3.7.1 Einführung 67
3.7.2 Lichtquelle 69
3.7.3 Optik zur Erzeugung der Lichtwellenlängen 69
3.7.4 Spaltbreite 69
3.7.5 Küvette 70
3.7.6 Detektor 72
3.7.7 Verwendung von Mikroplatten-Lesegeräten 72
3.7.7.1 Hochdurchsatz-Screening (HTS) 74
3.8 Anwendungen der Spektralphotometrie in den Biowissenschaften 76
3.8.1 Direkte Messungen von biologischen Molekülen 76
3.8.2 Chromophor-Assays 77
3.8.3 Enzymatisch katalysierte Reaktion 79
3.9 Zusammenfassung 86
3.9.1 Hinweise 86
4 Datenanalyse und Präsentation 87
4.1 Einführung 87
4.2 Statistische Datenanalyse: Wichtige Definitionen 89
4.2.1 Populationen und Stichproben 89
4.2.2 Variablen und Beobachtungen 89
4.2.3 Deskriptive Statistik 90
4.2.4 Messungen zur Streuung (Dispersion) 91
4.3 Verteilungen 93
4.3.1 Normalverteilung 93
4.3.2 Asymmetrische (nicht normale) Verteilung 97
4.3.3 Diskrete Wahrscheinlichkeitsverteilungen 97
4.4 Statistischer Datenvergleich 98
4.4.1 Vergleich von zwei Gruppen von Werten 99
4.4.1.1 Ungepaarte und gepaarte parametrische Tests (t-Tests) 99
4.4.2 Ungepaarte und gepaarte nicht parametrische Tests 102
4.4.3 Vergleiche von mehreren Datensätzen 103
4.4.4 Chi-Quadrat-Test für dichotome Variablen 104
4.4.5 Analyse der Beziehungen zwischen zwei Variablen: Lineare Korrelation und Regression 104
4.5 Darstellung, Struktur und Organisation von Daten in Laborberichten 108
4.5.1 Präsentation der Daten 109
4.5.2 Inhalt 112
4.5.2.1 Einführung 112
4.5.2.2 Ziele 112
4.5.2.3 Ergebnisse 112
4.5.2.4 Diskussion 112
4.5.2.5 Literaturangaben 113
4.5.3 Artikel in Journalen 113
4.5.4 Artikel in Büchern 114
4.5.5 Software zur Verwaltung von Literaturangaben 114
4.6 Zusammenfassung 114
5 Extraktion und Klärung von biologischen Stoffen 117
5.1 Einführung 117
5.2 Extraktion 117
5.2.1 Proteine 117
5.2.2 Desoxyribonukleinsäure 118
5.2.3 Lipide 119
5.2.4 Organellen 119
5.3 Extraktionsmethoden für tierisches und pflanzliches Gewebe 120
5.3.1 Mörser und Stößel 120
5.3.2 Homogenisatoren und Gewebemühlen 120
5.3.3 Mixer 121
5.4 Extraktionsmethoden für Bakterien 121
5.5 Klärung 123
5.5.1 Einführung in die Zentrifugation 123
5.5.2 Zentrifugen 126
5.5.3 Zentrifugenrotoren 127
5.5.4 Zentrifugenröhrchen 129
5.6 Zentrifugationstechniken 130
5.6.1 Differentialzentrifugation 130
5.6.2 Dichtegradientenzentrifugation 132
5.6.3 Gleichgewichts-Dichtegradientenzentrifugation 132
5.7 Gute Praktiken bei der Zentrifugation 133
5.8 Zusammenfassung 134
5.8.1 Hinweise 135
6 Elektrophorese von Proteinen und Nukleinsäuren 137
6.1 Allgemeine Einführung 137
6.2 Separation von Proteingemischen durch Gel-Elektrophorese 138
6.2.1 Herstellung von Elektrophoresegelen 138
6.2.2 Probenvorbereitung und Beladung 142
6.2.3 Ablauf der Elektrophorese 144
6.2.4 Praktische Hinweise und Tipps für die SDS-PAGE 148
6.2.4.1 Probenvorbereitung 148
6.2.4.2 Gelvorbereitung 149
6.2.4.3 Auftragen der Probe 149
6.2.4.4 Achtsamkeit während der Elektrophorese 150
6.2.4.5 Entfernung des Gels und Handhabung 150
6.2.4.6 Datenanalyse 151
6.2.4.7 Auswertung 151
6.3 Weitere Elektrophoresetechniken für Proteine 152
6.3.1 Nicht denaturierende (native) Gelelektrophorese 152
6.3.1.1 Andere Anwendungen von nicht denaturierender PAGE: In-situ- Detektion von Enzymaktivität 154
6.3.2 Celluloseacetatfolien-Elektrophorese 156
6.3.3 Western Blotting 156
6.3.4 Isoelektrische Fokussierung (IEF) und zweidimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese (2D-PAGE) 156
6.4 Trennung von Nukleinsäuren durch Gelelektrophorese 158
6.4.1 Probenvorbereitung 159
6.4.2 Vorbereitung und Anwendung von Agarosegelen 159
6.4.3 Färben von Gelen zum Nachweis von Nukleinsäuren 160
6.5 Anwendungen der Nukleinsäure-Gelelektrophorese 161
6.5.1 DNA-Fingerabdruck und PCR 161
6.5.2 RNA-Analyse 161
6.5.3 Puls-Feld-Gelelektrophorese (PFGE) 162
6.5.4 Identifizierung spezifischer Sequenzen mithilfe von Hybridisierungstechniken 163
6.5.5 DNA-Sequenzierung 164
6.6 Zusammenfassung 165
7 Chromatographie 167
7.1 Einführung 167
7.2 Theorie der Chromatographie 167
7.2.1 Verteilungskoeffizient (KD) in der Chromatographie 169
7.3 Bei der Chromatographie zu berücksichtigende Faktoren 172
7.4 Methoden zur Probenelution in der Chromatographie 174
7.5 Auswahl von Methoden, die zum Pufferaustausch und zur Probenkonzentrierung vor der Chromatographie verwendet werden können 176
7.5.1 Dialyse 176
7.5.2 Größenausschlusschromatographie (auch Gel-Permeations- Chromatographie, GPC) 178
7.5.3 Ultrafiltration 178
7.5.4 Zentrifugalverdampfer 180
7.5.5 Lyophilisierung (Gefriertrocknung) 181
7.6 Vakuumpumpen 182
7.7 Verschiedene Chromatographie-Arten und Eigenschaften, die zur Trennung von Molekülen genutzt werden 182
7.7.1 Adsorptionschromatographie 182
7.7.2 Verteilungschromatographie 183
7.7.3 Ionenaustauschchromatographie 183
7.7.4 Größenausschlusschromatographie (SEC) (auch Gel-Permeations- Chromatographie (GPC) 184
7.7.5 Affinitätschromatographie 184
7.8 Dünnschichtchromatographie (TLC) 185
7.9 Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) 186
7.9.1 Normalphasenchromatographie (NP), Umkehrphasenchromatographie (RP), Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) und Hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC) 189
7.10 Gaschromatographie (GC) 191
7.11 Ionenaustauschchromatographie (IEX) 192
7.11.1 Antikörperaufreinigung 194
7.12 Größenausschlusschromatographie (SEC) (auch Gel-Permeations-Chromatographie, GPC) 196
7.13 Affinitätschromatographie 198
7.14 Zusammenfassung 199
7.14.1 Hinweise 199
8 Zellkulturtechniken 201
8.1 Einführung 201
8.2 Wachstum und Pflege von Zellkulturen 206
8.2.1 Feste Nährmedien 207
8.2.1.1 Verdünnungsausstrich 207
8.2.1.2 Verdünnung mit Ausbreitungsplatte 210
8.2.1.3 Verdünnung mit Gussplatte 212
8.2.2 Weitere Anwendungen von Kulturmethoden in festen Nährmedien 212
8.2.2.1 Bakteriophagen-Nachweis 212
8.2.2.2 Pflanzliche Gewebekultur 214
8.2.3 Flüssige Nährmedien 216
8.2.3.1 Zellsuspensionskulturen 216
8.2.3.2 Alternativen zur Batch-Kultur 217
8.2.4 Flüssigkultur von eukaryotischen Zellen 219
8.2.4.1 Suspensionskultur 219
8.2.4.2 Monolayer-Kultur von Säugetierzellen 220
8.2.5 Zellaussaat für Experimente 221
8.2.6 Kryokonservierung von Zellen 222
8.3 Zusammenfassung 224
8.3.1 Hinweis 224
9 Antikörper-basierte Assays (Immunassays) 225
9.1 Struktur und Verwendung von Antikörpern 225
9.2 Reinigung, Markierung und Nachweis von Antikörpern 227
9.3 Immunassay-Methoden 231
9.3.1 Kompetitive Assays 231
9.3.1.1 Wichtige Schritte bei kompetitiven Immunassays 232
9.3.2 Nicht kompetitive Immunassays 238
9.3.2.1 Indirekter ELISA-Test (eine Stelle) 238
9.3.2.2 Sandwich-ELISA (zwei Bindungsstellen) 242
9.3.2.3 Immunblot 243
9.3.2.4 Dot Blot 244
9.3.2.5 Western Blot 245
9.3.2.6 Immunzytochemische und immunhistochemische Färbung 246
9.4 Kontrollen 250
9.5 Zusammenfassung 250
Vorschläge für weiterführende Literatur 251
Stichwortverzeichnis 255
Despre autor
Philip Bonner ist Programmleiter für den Masterstudiengang “Applied Biosciences” am Zentrum für Biomedizinische Wissenschaften der Nottingham Trent University (UK). Er verfügt über jahrzehntelange Erfahrung in der Aufreinigung von Proteinen und Peptiden und in der Enzymologie.
Alan Hargreaves ist Dozent an der Nottingham Trent University (UK). Er ist dort verantwortlich für das Master-Modul Zellkultur und Antikörpertechnologie und unterrichtet in mehreren weiteren Modulen, darunter Forschungsmethoden und Bioethik, Toxikologie, Biochemische Techniken und Neurowissenschaften.
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